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本应用笔记介绍了一种用于提高复杂蛋白质样品的分辨率的离线二维LC / MS方法。该方法采用连续盐梯度在第一个分离维度中进行分离，可在与分步洗脱相比，将复杂样品中鉴定出的蛋白质数量显著提高。此外，该方法还为研究人员提供了很高的灵活性，因为第一维的微分数可存储、重新分析或在进行进一步分析之前进行化学修饰。为了获得最佳分辨率，所采用的二维LC方法强烈需要优化两个分离维度。尤其是洗脱梯度、分析时间、静态相材料和柱尺寸需要合理设计和组装，以实现整体峰容量的显着增加。本应用笔记显示了影响变量和组件的实验数据。它可以作为指导方针，帮助研究人员为特定蛋白质样品调整分离方法，以便通过MS/MS分析获得最大肽序列信息。这将导致在数据库搜索后鉴定出更多的蛋白质。