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本应用笔记介绍了通过使用UHPLC的方法开发选项来分离维生素D2和D3的方法。使用C18柱和甲醇/乙腈流动相进行等度LC方法可部分分离维生素D2和D3。研究了多种优化参数以提高分辨率（Rs），包括柱选择性和柱长。2.1 mm × 150 mm Agilent ZORBAX StableBond-C18柱提供了最佳分辨率。进一步微调包括更快的流速和流动相强度，从而缩短了分析时间，从3分钟到1.5分钟，Rs为1.6到1.4。还比较了3.0 mm内径（id）柱的性能与2.1 mm id柱的性能，证明在紧密间隔的峰中没有分辨率损失之前，可以装载更多的样品。